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金沙国际集团  ◇  技术支撑  ◇  PCR引物设计原则概况
PCR引物设计原则概况
  • 发布日期:2016-03-08     信息来源:      浏览次数:1880
    • 实验步骤

      首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) ,再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点:

      1.引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp。

      2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。

      3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

      4.引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

      5.引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。合理的退火温度从55℃到70℃。为获得*结果,两个引物应具有近似的Tm值。
       

      6.引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。应该尽量避免。

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